Development of in-house serological methods for diagnosis and surveillance of chikungunya / Desarrollo de métodos serológicos propios para el diagnóstico y la vigilancia del chikungunya

ABSTRACT Objective To develop and evaluate serological methods for chikungunya diagnosis and research in Nicaragua. Methods Two IgM ELISA capture systems (MAC-ELISA) for diagnosis of acute chikungunya virus (CHIKV) infections, and two Inhibition ELISA Methods (IEM) to measure total antibodies against CHIKV were developed using monoclonal antibodies (mAbs) and hyperimmune serum at the National Virology Laboratory of Nicaragua in 2014-2015. The sensitivity, specificity, predictive values, and agreement of the MAC-ELISAs were obtained by comparing the results of 198 samples (116 positive; 82 negative) with the Centers for Disease Control and Prevention's IgM ELISA (Atlanta, Georgia, United States; CDC-MAC-ELISA). For clinical evaluation of the four serological techniques, 260 paired acute and convalescent phase serum samples of suspected chikungunya cases were used. Results All four assays were standardized by determining the optimal concentrations of the different reagents. Processing times were substantially reduced compared to the CDC-MAC-ELISA. For the MAC-ELISA systems, a sensitivity of 96.6% and 97.4%, and a specificity of 98.8% and 91.5% were obtained using mAb and hyperimmune serum, respectively, compared with the CDC method. Clinical evaluation of the four serological techniques versus the CDC real-time RT-PCR assay resulted in a sensitivity of 95.7% and a specificity of 88.8%-95.9%. Conclusion Two MAC-ELISA and two IEM systems were standardized, demonstrating very good quality for chikungunya diagnosis and research demands. This will achieve more efficient epidemiological surveillance in Nicaragua, the first country in Central America to produce its own reagents for serological diagnosis of CHIKV. The methods evaluated here can be applied in other countries and will contribute to sustainable diagnostic systems to combat the disease.

RESUMEN Objetivo Elaborar y evaluar métodos serológicos para el diagnóstico y la investigación del chikungunya. Métodos Se elaboraron dos sistemas de ELISA de captura de IgM (MAC-ELISA por sus siglas en inglés) para el diagnóstico de la infección aguda por el virus de (CHIKV) y dos métodos de ELISA de inhibición (MEI) para determinar el valor cuantitativo de los anticuerpos totales contra el CHIKV, en el Laboratorio Nacional de Virología de Nicaragua en 2014-2015, para lo cual se utilizaron anticuerpos monoclonales (AcMo) y sueros hiperinmunes. Se determinó la sensibilidad, la especificidad y los valores predictivos, así como la concordancia de los MAC-ELISA, comparando los resultados de 198 muestras (116 positivas y 82 negativas) con el ELISA de los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades de los Estados Unidos (Atlanta; MAC-ELISA-CDC). Para la evaluación clínica de las cuatro técnicas serológicas, se emplearon 260 muestras de suero obtenidas en la fase aguda y en la fase de convalecencia de presuntos casos de chikungunya. Resultados Se estandarizaron los cuatro métodos analíticos determinando las concentraciones óptimas de los diferentes reactivos. La duración del procesamiento se redujo sustancialmente en comparación con el MAC-ELISA-CDC. Con los sistemas de MAC-ELISA, se obtuvo una sensibilidad del 96,6% y del 97,4% y una especificidad del 98,8% y del 91,5% al utilizar AcMo y suero hiperinmune, respectivamente, en comparación con el método de los CDC. La evaluación clínica de las cuatro técnicas serológicas, en comparación con la PCR en tiempo real de los CDC, arrojó una sensibilidad del 95,7% y una especificidad del 88,8%-95,9%. Conclusiones Se estandarizaron dos sistemas de ELISA-MAC y dos de MEI y se comprobó que poseen la calidad adecuada para el diagnóstico y las investigaciones del chikungunya, con lo cual mejorará la eficiencia de la vigilancia epidemiológica en Nicaragua, el primer país centroamericano que produce sus propios reactivos para el diagnóstico serológico del CHIKV. Los métodos estudiados en este trabajo pueden aplicarse en otros países y contribuyen al desarrollo de sistemas de diagnóstico sostenibles para combatir la enfermedad.

Prevalence and factors associated to the epidemic neuropathy in a population assisted by a familiar doctor in Cuba

With the outbreak of an epidemic neuropathy (EN) of unknown ethiology, a study of the prevalence and factors associated to the disease was carried out in the Zamora community, municipality of Marianao, Havana City. There were 11 patients identified with EN for a prevalence rate of 1.7/100. The major risk group was the one between 45 and 64 years of age, female sex, black skin. In the univaried analysis, a high prevalence ratio (PR) was found linked to bevarage intake (PR=5.32 95 per cent; confidence intervals (CI) = 1.2-24.4), frequent drugs intake (PR=6.59; CI=1.8-24.6), consumption of edible of non certified fats (PR=4.48; CI=1.2-16.7) and the smoking habit (PR=3.6; CI=1.1-12.2). More than 73/100 (CI=68.7-78.3) of the people under serologic study were infected with Coxsakie virus A-9 (strain 47) isolated from a patient still under research. It seems there are many factors like linder intake, antecedents of hemorrhagic conjuntivitis, nutritional aspects and others that, with the virus isolated were associated with this epidemiologic situation.

Validacion de un ultramicroELISA de deteccion de anticuerpos contra el antigeno de superficie de la hepatitis B / Validation of an ultramicroELISA for the detection of antibodies against the hepatitis B surface antigen

Se presentan los resultados del estudio de validacion del ensayo ultramicroanalitico de deteccion de anticuerpos contra el antigeno de superficie de la hepatitis B (UMELISA anti HBsAg), que se realizo comparando los resultados obtenidos, con el juego diagnostico comercial Hepanostika anti-HBsAg. Se utilizaron para ello sueros procedentes de los ensayos clinicos de la vacuna recombinante cubana contra la hepatitis B. Con el primer panel de sueros (n = 300) se obtuvo el 93,1 por ciento de sensibilidad, el 98,5 por ciento de especificidad y una concordancia del 94,3 por ciento. El coeficiente de correlacion indico una tendencia similar de los resultados (p < 0,01) y no se encontraron diferencias significativas en el titulo promedio geometrico (TPG) entre ambos ensayos (P > 0,05). Con el segundo panel (n = 100), realizado en el Instituto de Medicina Tropical "Pedro Kouri" (IPK) y el Centro de Inmunoensayo (CIE) simulataneamente, se obtuvo una sensibilidad del 96,25 por ciento en ambos centros, una especificidad del 75 por ciento en el IPK y del 90 por ciento en el CIE y una coincidencia del 92 y 95 por ciento, respectivamente. El coeficiente de correlacion mostro valores similares y no hubo diferencias significativas entre las TPG alcanzadas por los 2 metodos (P > 0,05). Los resultados obtenidos en general muestran la validez del nuevo ensayo y la factibilidad de su utilizacion en la practica, ya sea para el seguimiento de la infeccion o para la realizacion de ensayos clinicos de evaluacion de vacunas

Neuropatia epidemica cubana. Parte III. Anticuerpos neutralizantes a cepas aisladas y otros Enterovirus en pacientes y personas sanas / Cuban epidemic neuropathy. Part III. Neutralizing antibodies to isolated strains and to other enteroviruses in patients and healthy subjects

Se realizaron determinaciones de anticuerpos neutralizantes en sueros de pacientes con neuropatia epidemica y de grupos de personas aparentemente sanas, a la cepa 47/93 IPK (CA9) y la 590 productora de efecto citopatico ligero (ECP-L), asi como a las cepas de referencia de CA9 y CB1-6, por la tecnica de microneutralizacion. Los enfermos y sus contactos mostraron porcentajes significativamente superiores de anticuerpos neutralizantes a la cepa 47-93 que el grupo considerado control y los residentes en municipios de baja tasa de la enfermedad. Esta diferencia tambien se comprobo en los titulos promedio geometrico (TPG) con las cepas de referencia de CA9 y CB2-4. Se comprobo un incremento de la circulacion de la cepa 47/93 en la poblacion infantil desde 1981 a 1993. Los enfermos mostraron porcentajes y TPG significativamente menores de anticuerpos neutralizantes a la cepa 590 que el grupo control, a pesar de que en 25/28 se habian aislados agentes con ECP-L. Se plantea la posibilidad de 2 mecanismos de neutralizacion y se formula una hipotesis sobre el mecanismo por el cual estos virus puedan participar en la fisiopatologia de la enfermedad

Utilizacion del ELISA y el ultramicroELISA en la identificacion de una cepa de Coxsackie A) aislada durante la epidemia de neuropatia en Cuba / Utilization of ELISA and ultramicroELISA techniques in the identification of a Coxackie straim A9 isolation during the outbreak of epidemic neuropathy in Cuba

Durante 1993, nuestro pais se vio afectado por un brote de neuropatia epidemica (NE) caracterizado por 2 formas clinicas fundamentales: optica y periferica. Aunque la causa de la enfermedad fue considerada multifactorial (fundamentalmente agentes neurotoxicos y deficiencia nutricional), fue aislado un Enterovirus del liquido cefalorraquideo de un paciente (cepa 47/93, IPK), el cual fue posteriormente clasificado como Coxsackie A9 (Cox A9) mediante la prueba de neutralizacion (Nt) utilizando los pools de suero de Lim Benyesh Melnick (LBM). Se presentan los resultados obtenidos durante la aplicacion del ELISA y del ultramicroELISA en la identificacion de este agente a partir del sobrenadante de cultivo de celulas infectadas, asi como en la deteccion de anticuerpos a la cepa en poblaciones con baja y alta incidencias de la enfermedad

Comparacion de los resultados obtenidos en la serologia de IgM y la neutralizacion anti-Coxsackie A9 (cepa 47) en casos de neuropatia epidemica y sus contactos / Comparison of the results obtained in IgM serology and the neutralization of anti-Coxsackie A9 (strain 47) in cases presenting with epidemic with epidemic neuropathy and their contacts

Se estudio un total de 213 monosueros de pacientes con el diagnostico de neuropatia epidemica y sus contactos, por las tecnicas de inmunofluorescencia indirecta y neutralizacion, con el fin de demostrar la presencia de anticuerpos IgM y neutralizantes en los sueros frente a la cepa 47 IPK/93 identificada como Coxsackie A9. La edad promedio de estos pacientes oscilo entre 20 y 50 anos y la positividad a ambas tecnicas no predomino. No hubo diferencia significativa en los resultados obtenidos entre pacientes y contactos en las tecnicas empleadas

Marcador serológico como indicador de no circulación de Poliovirus en Cuba / Serological marker as an indicator of no circulation of Poliovirus in Cuba

En la erradicación de la poliomielitis la vigilancia de la circulación del Poliovirus salvaje es un elemento esencial. La organización Panamericana de la Salud está enfatizando con estos fines el estudio etiológico de la parálisis fláccidas agudas. Las características de nuestro programa de lucha contra esta enfermedad, permitió utilizar la presencia de anticuerpos en una muestra, obtenida en febrero, de la población infantil nacida en el mes de julio del año anterior como criterio para conocer la circulación del Poliovirus salvaje. En 727 niños estudiados en el país (5 por ciento del total de los nacimientos de julio), no mostraron anticuerpos en títulos igual o mayor de 1:10 el 99,1 por ciento . Los títulos bajos encontrados en 7 niños fueron considerados como remanentes de los trasmitidos por la madre. Los resultados obtenidos son un fuerte argumento de no existir circulación ambiental de Poliovirus en el período que históricamente existía mayor incidencia de la enfermedad

Marcador serológico como indicador de circulación de poliovirus / Serological tracer as indicator of poliovirus circulation

Para erradicar la poliomielitis, resulta esencial demostrar la no circulación de poliovirus salvaje. Debido a que las vacunaciones antipoliomielíticas en Cuba se realizan en forma de campañas de cobertura nacional de muy corta duración, podemos adoptar como criterio de circulación la presencia de anticuerpos en los nacimientos que ocurran entre las campañas una vez perdida la inmunidad trasmitida por la madre. El estudio del 5 por ciento de esa población mostró anticuerpos neutralizantes a poliovirus sólo en 7(1.2 por ciento ) de 724 niños estudiados. Los bajos títulos encontrados, la dispersión geográfica, la no ocurrencia de casos de poliomielitis durante el período, la no circulación en la región del serotipo al cual pertenecen estos anticuerpos son, entre otros, elementos que permiten intepretar la presencia de los mismos como remanentes de la inmunidad pasiva trasmitida por la madre